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糖皮质激素治疗不同时期实验性自身免疫性卵巢早衰

作者:廖灿 施晓波 李娜 符书馨发布时间:2015-04-07 17:16:00
    【摘要】

    目的:探讨糖皮质激素对实验性自身免疫性卵巢早衰不同发病时期的影响,为临床治疗提供新的启发。

    方法:将50只小鼠随机分为空白组、模型组、糖皮质激素早、中、晚期治疗组共5组,每组10只。空白组于后脚掌注射三蒸水0.1ml,其余组注射CFA-pZP3(完全弗氏佐剂-透明带多肽)混合液,建立实验性自身免疫性卵巢早衰模型。早、中、晚治疗组分别于免疫第10,15,20天开始腹腔注射地塞米松各3个性周期(约15天),模型组及空白组与中期治疗组同步腹腔注射三蒸水,并以性周期的改变、血清抗透明带抗体浓度、病理学检查、及免疫组化检测卵巢组织中CD45阳性细胞的浸润程度作为疗效观察指标。

    结果:1.中期治疗组小鼠的性周期紊乱率、外周血抗透明带抗体平均值、卵巢组织CD45阳性率分别为30%、18.67 μg/L、10%,相较于模型组对应值分别为100%、33.05 μg/L、90%明显减低;中期治疗组小鼠卵巢组织生长卵泡比率为 41.35%,明显高于模型组23.7%,且各项差异均有统计学意义,P<0.05。2.早、中、晚治疗组小鼠外周血抗透明带抗体平均值分别为27.22 μg/L、18.67 μg/L、27.04 μg/L,中期治疗组明显低于早晚期治疗组;三组小鼠卵巢组织生长卵泡比率分别为30.53%、41.35%、33.64%,中期治疗组明显高于其他两组,各项差异均有统计学意义,P<0.05。而早晚期治疗组比较则无明显差异,P
0.05。

    结论:1.糖皮质激素用于自身免疫性卵巢早衰疗效肯定;2.糖皮质激素对不同时期实验性自身免疫性卵巢早衰小鼠进行干预,中期疗效优于早期或晚期。

    关键词】:自身免疫性卵巢早衰;pzp3;动物模型;糖皮质激素;治疗时机

Treat the experimental Autoimmune Premature Ovarian Failure in different timing

with Glucocorticoids

    【Abstract】Objective: Discuss the treatment effect in difference timing of experimental autoimmune premature ovarian failure(POF) with glucocorticoids. Method: The 50 mice were randomly divided into the control group, the model group and the early、the medium-time、the late glucocorticoid treatment group,10 in each group. The control group mice were injected with distilled water in the sole while the rest mice were injected with CFA-PZP3 mixed solution to set up the animal model of experimental autoimmune POF.The early, medium-time,late teatment groups begin to treat with glucocorticoid by intraperitoneal injection separately on the 10th,15th,20th day from the CFA-PZP3 inject day, while the model and control group were injected with distilled water the time as the medium-time group. They were all treated and observed 3 sex cycles. The observed standards were:1.The change of sex cycle; 2.Detection of AzpAb serum level by ELISA; 3. Observation of the histological changes of the mice by HE slicing under optical microscope; 4. Evaluation of the severity of autoimmune oophoritis by examining the infiltration of CD45 expressing in the ovary. Result:①The medium-time treatment group’s sex cycle disorder rate/the AzpAb level in serus/the expression rate of CD45 seperately were 30%、18.67 μg/L、10%,obviously lower than the model group whose value were 100%、33.05 μg/L、90%; the growing follicle rate in the medium-time treatment group was 41.35%,obvously higher than the model group whose value was 23.7%, the difference all had statistical significance,P<0.05.②The early、the medium、the late treatment group’s AzpAb level in serus seperately were 27.22 μg/L、18.67 μg/L、27.04 μg/L,the medium treatment group were obviously lower than the rest groups;their growing follicle rate seperately were 30.53%、41.35%、33.64%,the medium treatment group were obviously higher than the rest groups, the difference all had statistical significance, P<0.05;the early and late treatment group had no statistical significance comparison with each other, P0.05. Conclusion: 1. Glucocorticoid can treat the autoimmune POF effectly. 2. Glucocorticoid treat the autoimmune POF mice the most effective in medium-time.

    Key Words】Autoimmune premature ovarian failure; pzp3;The animal model; Glucocorticoid; Treatment timing

 

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指月经初潮年龄正常或青春期延迟、第二性征发育正常的女性在40岁之前出现闭经,其卵泡刺激素及黄体生成素水平升高,雌激素水平降低的一种综合征。POF的发病率1.0%~3%。迄今为止该病病因和发病机制尚不清楚,多数学者认为POF 最常见的原因是自身免疫功能异常约占20%。

目前对自身免疫性POF的治疗缺乏有效的病因治疗。近年来有研究显示用糖皮质激素(Glucocorticoids,GC)大剂量短疗程进行免疫抑制治疗可取得一定的疗效,但仍缺乏大样本研究。自身免疫性POF为渐进性疾病,及时发现和治疗可控制疾病的发展,改善预后。因此,本研究通过建立实验性自身免疫性POF小鼠模型,应用GC在其不同发病时期进行治疗并观察其疗效,初步探讨其作用机制,进一步指导临床治疗工作。

 

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物 近交系小鼠(C57BL /6xA /J ),雌性,7~9周龄,体重21~23g,共100只,购于北京大学医学部动物中心。按SPF级动物要求,饲养在无特定病原体环境中,所用饲料、饮水及垫料均经高压灭菌处理。

    1.1.2 多肽合成 根据小鼠透明带( zona pellucida,ZP)3的第330~342个氨基酸序列(NSSSSQFQ IHGPR),合成透明带多肽( pZP3 ),由杭州中肽生化有限公司合成,经HPLC分析纯度90%。

    1.1.3 糖皮质激素  采用天津药业焦作有限公司生产的地塞米松磷酸钠注射液(5mg/1ml/支)。

    1.2 方法:

    1.2.1 分组 从100只小鼠中选出50只经过观察性周期正常小鼠,随机将小鼠分为5组,每组10只,分别为空白组、模型组及糖皮质激素早、中、晚期治疗组。

    1.2.2 建立实验性自身免疫性POF动物模型 空白组小鼠于双后脚掌处进行皮下注射三蒸水0.1ml,其余各组小鼠注射CFA-pZP3 混合液0.1ml,其中包含CFA: 0.05ml,pZP3:50nmol。

    1.2.3 治疗 免疫注射当天为第0天,早、中、晚期治疗组分别于第10、15、20天开始,每天腹腔注射地塞米松0.05ml(0.25mg),空白组及模型组与中期治疗组同步每日腹腔注射三蒸水 0.05ml,持续治疗3个性周期(15天),各组均于治疗15天后摘眼球取外周血,取血后处死小鼠取双侧卵巢保存于10%福尔马林中性溶液。

    1.3 判断指标

    1.3.1 鼠阴道脱落细胞学检查判断小鼠性周期变化情况 

    每天早晚各取一次阴道脱落细胞,Giemsa染色后光学显微镜下观察。本实验采用的小鼠正常性周期为4~6天,包括动情前期(9~18h)、动情期(6~12h)、动情后期(30~48h)和动情间期(36~42h)。各期阴道脱落细胞涂片分别表现为
:(1)动情前期:大量的有核上皮细胞和少量角化上皮细胞;(2)动情期:满视野角化上皮细胞和少量有核上皮细胞;(3)动情后期:少量角化上皮细胞和大量白细胞;(4)动情间期:白细胞和少量粘液。

由于下丘脑-垂体-卵巢轴的调节作用,使雌、孕激素呈现规律性的波动,同时小鼠阴道粘膜表层细胞也随雌、孕激素的波动而变化,即表现为性周期。当卵巢发生病变、影响卵泡正常发育的情况下,即可导致机体性周期的紊乱。

    1.3.2  ELISA检测小鼠外周血清中抗透明带抗体(AzpAb)的表达

透明带是覆盖于卵母细胞及着床前受精卵外的一层基质,其中ZP3具有很强的抗原性,主动或被动免疫动物均可诱发产生抗体。机体发生自身免疫异常 ,产生AzpAb是导致 POF的一个重要原因。本实验以ELISA检测小鼠外周血清中AzpAb的表达判断小鼠自身免疫活跃程度。

    1.3.3 免疫组化检测卵巢组织中淋巴细胞的浸润程度判断其免疫反应状态

皮下注射pZP3后小鼠发生自身免疫异常,在产生AzpAb攻击自身卵母细胞ZP的同时,活化的自身反应性免疫细胞也增多,这些细胞均攻击靶器官——卵巢,导致以淋巴细胞、浆细胞等免疫细胞浸润为主要特征的自身免疫性卵巢炎。

本实验用免疫组化检测卵巢组织中淋巴细胞(CD45阳性)的浸润程度判断自身免疫性卵巢炎的病变程度,分为 1~4个等级,1 级:炎症累积卵巢间质,未浸润卵泡。2 级:炎症已经累积卵泡,但炎细胞浸润程度较轻或受累卵泡数量少于 5个。3 级:受累卵泡数量多于 5个,或炎细胞浸润程度重,或出现炎性肉芽肿。4 级:卵巢内卵泡明显减少,并且停留在始基卵泡阶段,不能继续生长为成熟卵泡,或出现卵巢萎缩
    1.3.4 卵巢组织学检查判断卵巢萎缩受损程度  

发生自身免疫性卵巢炎后,免疫细胞的浸润随病变进展逐渐累及卵泡,不断地浸润和破坏颗粒细胞,使颗粒细胞层逐渐减少,且浸润的免疫细胞密度也增加,因此受累卵巢只见始基、闭锁卵泡,很少有卵泡能够发育或成熟,病变进一步发展则可导致卵巢萎缩。本研究以(生长卵泡+成熟卵泡)/总卵泡数来表示卵巢萎缩受损程度。

    1.4 统计分析

应用SPSS13.0版软件处理数据,计量资料以均数±标准差( )表示,计数资料以率表示。两样本均数比较采用Mann-Whitney Test进行统计学分析;两样本率的比较采用Fisher’s确切概率法进行统计学分析。P<0.05认为具有统计学意义。

 

    2 结果

    2.1 本实验各组小鼠性周期的改变:

根据动态观察性周期改变,本实验中小鼠性周期出现以下几种改变情况:性周期正常、性周期延长(7~10天)、无明显性周期及性周期停滞。空白组、模型组及早、中、晚期治疗组小鼠性周期紊乱率分别为10%、100%、50%、30%、60%,其中①模型组小鼠性周期紊乱程度显著高于空白组,P0.001②中期治疗组小鼠性周期紊乱程度显著低于模型组,P =0.003;③早、中、晚期治疗组两两比较差异均无统计学意义,P>0.05(见表1、表2)

    2.2 各组小鼠外周血抗透明带抗体的比较

采用ELISA方法对各组小鼠外周血抗透明带抗体进行定量检测,空白组、模型组及早、中、晚期治疗组小鼠外周血清AzpAb平均浓度分别为(ug/L)17.55±3.52、33.05±9.07、27.22±6.42、18.67±6.31、27.04±8.17,其中①模型组小鼠外周血AzpAb平均浓度显著高于空白组,P<0.001;②中期治疗组小鼠外周血AzpAb平均浓度显著低于模型组,P=0.002;③中期治疗组小鼠外周血AzpAb平均浓度明显低于早、晚期治疗组,P分别为:P=0.008,P=0.016;早、晚期治疗组比较无统计学差异,P>0.05。(见表1、表2)

    2.3 各组小鼠卵巢组织CD45的浸润程度

将各组小鼠处死后取卵巢组织制成病理切片进行免疫组化,根据CD45浸润情况按照前文所述标准进行自身免疫性卵巢炎的病变程度分级,空白组、模型组及早、中、晚期治疗组小鼠卵巢组织CD45阳性浸润率分别为 30%、90%、40%、10%、50%,其中①模型小鼠卵巢组织CD45阳性浸润率明显高于空白组,P =0.020;②中期治疗组小鼠卵巢组织CD45阳性浸润率明显低于模型组,P=0.001;③早、中、晚期治疗组两两比较差异均无统计学意义,P>0.05。(见表1、表2)

    2.4 各组小鼠卵巢组织病理学改变的比较

将各组小鼠处死后取卵巢组织制成病理标本并进行HE染色,在显微镜下观察卵巢组织中卵泡情况。本研究以(生长卵泡+成熟卵泡)/总卵泡数(下文简称发育卵泡比例)来表示卵巢萎缩受损程度。空白组、模型组及早、中、晚期治疗组小鼠卵巢组织发育卵泡比例分别为(%):42.59±7.35、23.7±5.97、30.53±6.45、41.35±7.8、33.64±4.4,其中①模型组小鼠发育卵泡比例均明显低于空白组,P<0.001;②中期治疗组小鼠发育卵泡比例明显高于模型组,P<0.001;③中期治疗组小鼠发育卵泡比例明显高于早、晚期治疗组,P分别为:P=0.006,P=0.019;早期治疗组与晚期治疗组比较无统计学差异,P>0.05。(见表1、表2)

表1:各组小鼠实验指标改变情况

 

组别

 

(只)

性周期紊乱(只)

外周血清AzpAb浓度(ug/L)

x ± s

自身免疫性卵巢炎程度(只)

(生长卵泡+成熟

卵泡)/总卵泡数(%)

x ± s

性周期延长

无明显性周期

性周期停滞

性周期紊乱率

1

2

3

4

CD45

阳性率

空白组

10

1

0

0

10%

17.55±3.52

2

1

0

0

30%

42.59±7.35

模型组

10

5

2

3

100%

33.05±9.07

0

2

3

4

90%

23.70±5.970

早期治疗组

10

1

0

4

50%

27.22±6.42

4

0

0

0

40%

30.53±6.45

中期治疗组

10

0

0

3

30%

18.67±6.31

0

1

0

0

10%

41.35±7.80

晚期治疗组

10

3

0

3

60%

27.04±8.17

2

1

2

0

50%

33.64±4.40

 

 

          表2:各组小鼠实验指标统计学比较情况

 

比较组别

性周期紊乱

外周血清AzpAb浓度

CD45阳性率

(生长卵泡+成熟卵泡)/总卵泡数

P

Z

P

P

Z

P

模型组与空白组

0*

-3.554

0*

0.020*

-3.672

0*

中期治疗组与模型组

0.003*

-3.024

0.002*

0.001*

-3.708

0*

中期治疗组与早期治疗组

0.65

-2.246

0.008*

0.300

-2.765

0.006*

中期治疗组与晚期治疗组

0.37

-2.419

0.016*

0.140

-2.344

0.019*

早期治疗组与晚期治疗组

1

-0.227

0.82

1.000

-0.987

0.324

 

注:*表示有统计学意义

 

      讨论

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是一种多病因所致的卵巢功能衰竭,一般人群中发病率1%~3%。近年来发病率有逐年上升趋势,其导致的不孕及低雌激素并发症给患者带来巨大的生理和心理上的痛苦。随着人们生活水平的提高,女性的生殖健康受到了越来越多地重视。自身免疫异常是POF最常见的病因。

    3.1 POF的免疫学因素

POF患者的卵巢自身免疫损害机制尚不清楚,可能是自身免疫功能亢进产生的抗体,能识别卵巢构成的某一或某些成分,通过抗原抗体反应损毁卵巢。最近有研究显示,POF 患者出现的免疫异常,不仅与其细胞数量有关,还与其调节功能即淋巴细胞亚群失衡有关。尚有研究发现, POF 也可能与排卵时伴有血管损伤有关,卵泡的某些成分因此进入血液循环,刺激抗体产生。新近有研究表明ZP更是自身免疫性卵巢早衰的重要抗原,因育龄妇女在每次排卵后局部反复吸收 ZP抗原,但当机体遭受与ZP有交叉抗原性反应的其他抗原再次刺激后,产生的各种致病因子可使 ZP变性,体内免疫识别功能发生障碍导致免疫调节功能失调,使机体对 ZP的正常免疫耐受反应发生障碍,最终导致对 ZP免疫应答产生抗透明带抗体。该抗体可与卵母细胞透明带结合,干扰卵母细胞与颗粒细胞之间的信息交换,导致卵母细胞加速破坏和耗竭而致POF,此外也可形成免疫复合物沉淀,阻止精子对透明带的粘附而干扰受精

    3.2 GC治疗

理论上讲,用GC等免疫抑制剂可对自身免疫性卵巢早衰治疗取得一定的效果,但对其用量及治疗时机的研究尚无明确定论。因此建立实验性自身免疫性POF动物模型作为平台对探索GC对该病的病因治疗有较重要的意义。

本实验注射pZP3后,与空白组比较,模型组小鼠性周期紊乱率、外周血AzpAb浓度、CD45阳性浸润率明显升高,卵巢组织发育卵泡比例显著降低,P0.05,提示模型组小鼠发生了不同程度的自身免疫性卵巢炎,并且这种组织学表现与人类POF患者的卵巢组织学表现十分相似,由此证明本实验利用pzp3已成功地诱导实验性自身免疫性POF的发生。

    3.2.1 GC治疗疗效

GC类药物作为免疫抑制剂作用于临床的历时已久,其抗炎、免疫抑制作用已得到充分证实。其免疫抑制作用主要是通过抑制T淋巴细胞的激活和淋巴因子的产生介导,可以导致 T 淋巴细胞减少、特别是 CD4+T 细胞减少,抑制 T 细胞诱导的细胞毒作用,减少 Th1 细胞因子的分泌,降低患者血清中 IL-10 水平,还可使 B 细胞和巨噬细胞耗竭,使免疫球蛋白水平轻度降低。此类药物有泼尼松、氢化泼尼松和地塞米松等,对免疫反应的多个环节均有抑制作用。

本实验在成功建立实验性自身免疫性POF小鼠模型的基础上,用地塞米松对治疗组小鼠进行腹腔注射,中期治疗组与模型组相比较在各项指标上均明显改善,P0.05,且从卵巢炎分级中看来,经地塞米松治疗后小鼠的卵巢炎多处于12级,而模型组多处于34级。由此可见,GC确实可有效的治疗POF,这一点与其他学者的研究也相符合。

    3.2.2 GC治疗时机的探讨

已有研究证实自身免疫性卵巢早衰与细胞免疫和体液免疫均有相关性,在发病早期,以细胞免疫为主,抑制性T细胞(Ts)百分率降低,辅助性T细胞(Th)与Ts的比率(Th/Ts)增高,自然杀伤细胞比率下降,B淋巴细胞数目升高,人类白细胞抗原(HLA)DR+T细胞升高。免疫细胞的异常引起卵巢损伤或排卵时卵巢细胞进入血液,引发自身免疫反应,从而产生抗卵巢组织的自身抗体,导致卵细胞破坏、闭锁和耗竭、无排卵,甚至不孕。

在自身免疫性POF发病早期,运用GC等免疫抑制剂进行干预,主要通过抑制T淋巴细胞的激活和淋巴因子的产生,使 B 细胞和巨噬细胞耗竭,减少免疫细胞聚集,达到对细胞免疫的抑制作用,从而减轻卵巢损伤,阻止受损的卵巢细胞进入血液进一步诱导或加重体液免疫,起到对自身免疫性POF的治疗作用。因此,早期发现及治疗自身免疫性POF可以阻断或逆转其疾病进展,对临床治疗有十分重要的指导意义。

本实验在不同发病时期对实验性自身免疫性POF小鼠进行干预,结果发现:在小鼠病理学检查及ELISA测小鼠外周血抗透明带抗体这两个客观指标上,中期治疗组疗效明显优于与

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